作者:   發(fā)布時間:2014/6/27 10:36:05   瀏覽次數(shù):2255

一種鑒別氨基酸的新型陣列傳感器

氨基酸是生物代謝過程中的重要物質(zhì)，是構(gòu)建細胞、修復(fù)組織的基礎(chǔ)材料。氨基酸的快速識別對細胞代謝分析具有重要意義。目前，氨基酸檢測分析方法有氣相色譜( GC)、液相色譜( HPLC)和毛細管電泳(CE)等各種色譜法。這些方法雖然具有精確度高和檢出限低的優(yōu)點，但這些檢測方法均需要借助大型儀器，同時樣品前處理時間長，不利于樣本的快速檢測。受到哺乳動物味覺系統(tǒng)的啟發(fā)，一種新型的檢測分析技術(shù)近年來受到重視，即基于交叉響應(yīng)原理的陣列傳感器。目前，對于此類傳感器的研究已經(jīng)有相關(guān)報導(dǎo)，識別對象包括金屬離子，有機小分子，肽類等。其識別原理如圖1所示．該傳感器由多個傳感點構(gòu)成，每個傳感點對于分析對象呈現(xiàn)不同的響應(yīng)度，綜合所有傳感點的信息構(gòu)成了分析對象的識別圖譜，從而區(qū)分和檢測分析對象。傳感點不必具有特異性，只需對于不同的分析對象有不同作用力，從而產(chǎn)生了針對分析物的識別模式。該研究構(gòu)建了鑒別氨基酸的液體陣列傳感器，對9種常見的氨基酸進行了識別，對氨基酸類化合物的快速識別進行了探索研究。
1試驗部分
1.1試劑與儀器
9種氨基酸：谷氨酰胺( Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)，均為分析純，購自Sigma - Aldrich公司。
7種染料：溴甲酚紫、溴酚紅、亮黃、甲基紫、吖啶橙、間胺黃和孔雀綠，均為分析純，購自Sipna - Aldrich公司。四磺酸基四苯基卟啉(TPPS4)（純度為99%），購自美國FrontierScienti6c公司。
超純水由MiUipore Direct-Q Water system（法國Molsheim公司）制備。Imark酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）。
l.2試驗過程
1 2.1試驗樣品的準(zhǔn)備
試驗以9種氨基酸為檢測對象，包括谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸、絲氨酸、纈氨酸以及甲硫氨酸。9種氨基酸分別用超純水定容至50mL，濃度均為375umol/L，備用。
1.2.2陣列構(gòu)建與檢測方法
液體陣列構(gòu)建時，選用的傳感物質(zhì)不需進行特異性設(shè)計，但為了保證其交叉響應(yīng)的特性和光譜信號的實現(xiàn)，傳感物質(zhì)的選擇需要考慮以下2個方面：
(l)傳感物質(zhì)具有多個作用位點，易與分析物發(fā)生相互作用；
(2)具有生色基團，當(dāng)傳感物質(zhì)與分析物進行結(jié)合時，會引起光譜變化。
該傳感器構(gòu)建前期進行了大量光譜學(xué)研究，經(jīng)過試驗篩選出7種染料與1種卟啉化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與測定波長如圖2所示。該傳感器構(gòu)建在96孔板上，其布局如圖3所示。一列的8個孔構(gòu)成一個陣列，相當(dāng)于一個傳感器。1塊96孔板則相當(dāng)于含有12個傳感器，可以同時對12個樣本進行分析。檢測前，向每列的8個孔中分別加入1OO uL對應(yīng)的傳感物質(zhì)S1-S8。分析檢測時，向此8孔中同時加入1OOuL的分析樣本，20℃下振蕩10min，測定對應(yīng)波長下的OD值。每個樣本進行3個平行樣測定，每個平行樣的檢測結(jié)果包含了8個光譜數(shù)據(jù)，所有樣該實驗數(shù)據(jù)組成了一個(9×3) x8維的矩陣，將這些原始光譜數(shù)據(jù)作為輸入變量進行模式識別分析。

一種鑒別氨基酸的新型陣列傳感器
2結(jié)果與討論
2.1聚類分析
聚類分析（Hierarchical clusLer analysis，HCA）是一種常用的統(tǒng)計分析方法。利用聚類分析，由聚類圖可以直觀地判斷所采用的液體陣列傳感方法對于9種氨基酸的區(qū)分能力，同時聚類圖還表示了不同類別氨基酸的相似程度。用歐氏距離定義樣品之間的相似度，用組間連接來定義集群。利用SPSS軟件對27次試驗所獲得的數(shù)據(jù)進行HCA分析，結(jié)果如圖4所示。在HCA圖上，9種氨基酸被完全分開，由此可見，所構(gòu)建的液體傳感陣列對于氨基酸具有強大的識別能力。由圖4可見，當(dāng)歐式距離為25時，9種氨基酸可以分成兩大簇，其中賴氨酸和組氨酸形成一簇，而其他的7種氨基酸為一簇。從理化性質(zhì)上分析，賴氨酸與組氨酸均為堿性氨基酸，且均為極性帶正電氨基酸。而谷氨酸與這兩種氨基酸的歐式距離最遠，是因為谷氨酸為酸性氨基酸，且為極性帶負電氨基酸。而纈氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸與絲氨酸形成一簇，這5種氨基酸分子均含有一個羧基和一個氨基，在酸堿度上表現(xiàn)為中性氨基酸。同時，分析這5種氨基酸的極性發(fā)現(xiàn)，纈氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸均為非極性氨基酸，而甘氨酸和絲氨酸雖然為極性氨基酸，但是這2種氨基酸均為極性不帶電氨基酸。分析HCA圖可知，9種氨基酸的區(qū)分主要是基于氨基酸之間的酸堿度與極性的不同，追溯到陣列構(gòu)建上，傳感陣列對于分析物酸堿度和極性的識別能力主要來源于所選擇的敏感物質(zhì)中包括了酸堿指示劑和極性指示劑。另外，卟啉等物質(zhì)對于不同功能基團具有很好的識別效果，這可能也是陣列能夠?qū)λ釅A度和極性相近的氨基酸進行區(qū)別的一個重要原因。
2.2 LDA判別分析
判別分析是在分類確定的條件下，根掘某一研究對象的各種特征值判別其類型歸屬問題的一種多變量統(tǒng)計分析方法。它按照一定的判別準(zhǔn)則，建立—個或多個判別函數(shù)，用研究對象的大量資料確定判別函數(shù)中的待定系數(shù)，并計算判別指標(biāo)。根據(jù)建立的判別函數(shù)判斷未知樣本的類型歸屬。利用判別分析可以從液體陣列上的反應(yīng)指紋信息中提取2個或3個包含綜合信息的函數(shù)，將這幾個函數(shù)作為坐標(biāo)就可以將指紋信息可視化為一張散點圖（圖5）。每個判別分析散點圖上的點都代表了—個分析樣品與陣列反應(yīng)的識別結(jié)果：聚在一起表明這些點所代表的分析樣品與陣列的識別反應(yīng)模式相近，反之，點之間的距離越遠則表明這些點所代表的分析樣品與陣列的識別反應(yīng)模式差別大。

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